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人造细胞的又一进展,在脂质体中进行基因控制膜合成

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  • 发布时间:2020-09-04 11:22
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【概要描述】荷兰代尔夫特理工大学Kavli纳米科学学院生物科学系Adriana Calaça Serrão & Christophe Danelon两位学者于Nature communications发表文章Genetically controlled membrane synthesis in liposomes其研究在最小细胞模型中为DNA程序膜合成提供了实验证据。

人造细胞的又一进展,在脂质体中进行基因控制膜合成

【概要描述】荷兰代尔夫特理工大学Kavli纳米科学学院生物科学系Adriana Calaça Serrão & Christophe Danelon两位学者于Nature communications发表文章Genetically controlled membrane synthesis in liposomes其研究在最小细胞模型中为DNA程序膜合成提供了实验证据。

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2020年8月荷兰代尔夫特理工大学Kavli纳米科学学院生物科学系Adriana Calaça Serrão & Christophe Danelon两位学者于Nature communications发表文章Genetically controlled membrane synthesis in liposomes其研究在最小细胞模型中为DNA程序膜合成提供了实验证据。

生物细胞在空间上被脂质膜界定。尽管古细菌膜由醚脂质组成,但其他细胞类型都使用磷脂作为最丰富的膜成分。在广泛的实验条件下,大多数磷脂在水溶液中自组装形成称为脂质体的囊泡。脂质体内生化过程的空间组织模仿了自然细胞的基本特征。因此,磷脂囊泡提供合成的最小单元的相对简单的模型系统的结构的底盘。

与细胞生命的有效定义有关的还有自我维护的概念,这与将基本细胞视为自生单元的观点一致,由此所有系统组件都在其边界内产生。存在于外部环境中的底物吸收到膜上或扩散到整个膜上,并通过代谢过程转化为分子构件。在描述生物细胞的内部功能时特别重要的另一个方面是不同子系统之间的耦合,例如遗传信息,蛋白质合成和膜成分的代谢合成。本文中,作者将此概念框架应用于可产生其自身膜成分的最小细胞的构建。DNA程序指导的无细胞蛋白质和磷脂合成是在脂质体内进行的,构成了自主生长和分裂的人工细胞发展过程中的整合步骤。

之前的研究已经描述了各种策略来生长脂质体。在外部介质直接供给在单体,胶束或小单层囊泡可以自发吸附或熔合到脂质体膜的形式膜组分,增加其表面积。此外,非酶机制,以从合成的反应性前体产生的膜脂质和催化剂是特别有效的,从而导致大量的小泡生长。为了在脂质区室与其内部内容之间建立联系,可以使脂质体的生长取决于封装的核酸或催化剂。

这种模型系统因其分子简单性而具有吸引力,并且可能类似于现代生物学出现之前的原始细胞。更接近在当代细胞中发生的过程,磷脂酶催化生物合成已经使用纯化的蛋白质已经实现。此外,脂质生产酶的DNA编码,并且通过内部的脂质体在体外蛋白质合成表达,提供了基因型对表型连锁。大肠杆菌酶3磷酸甘油(G3P)酰基转移酶和溶血磷脂酸(LPA)酰基转移酶,其基因名称分别称为PlsB和PlsC,是从两个DNA模板原位表达的。在两步酶促反应中,前体G3P和脂肪酰基辅酶A(酰基-CoA)依次转化为溶血磷脂酸和磷脂酸(PA)脂质(图1a)。

但是,输出的磷脂PA不是原始膜组成的一部分,并且PA检测方法与单囊泡分辨率不兼容。脂质体膜主要成分的再生需要重构另外五个头基修饰酶,这些酶与PlsB和PlsC一起形成肯尼迪代谢途径,该途径产生磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰甘油(PG),这是E中最丰富的脂质大肠杆菌膜 尽管可以从脂质体的外部实现Kennedy途径酶的不受调控的表达,但是在水泡中合成具有可控分子比的成膜脂质仍然是一个挑战。

图1:从头合成酶对PE和PG的遗传控制生产。

在目前的工作中,作者表明,从较简单的前体中合成PE和PG脂质可以在含有PE和PG的脂质体内进行遗传控制。作者的结果为基于脂质体的人工细胞中DNA编码的膜合成提供了实验证据。因为代谢途径包含7种不同的酶,所以作者首先将所有7个基因组装在一个质粒上。PURE(使用重组元素的蛋白质合成)系统,此处为PURE frex2.0用作最小的无细胞蛋白质合成平台,可将DNA程序转换为完整的酶促途径。通过定量液相色谱-质谱法(LC-MS)证明脂质体内的磷脂生物合成。PE和PG的相对含量是通过转录和代谢调节机制定制的。此外,作者开发了基于荧光的探针,可以直接在单个囊泡水平上可视化合成磷脂的膜结合。

 

 

磷脂生物合成微型基因组的设计

 

 

作者的目标是从所有七个酶编码的基因开始重构大肠杆菌的肯尼迪磷脂合成途径(图  1a)。膜结合蛋白PlsB使用酰基辅酶A(或酰基载体蛋白,ACP)作为供体来酰化G3P的1位以形成LPA 。随后,2-被膜蛋白PlsC酰化形成二酰基PA,再次使用酰基辅酶A作为脂肪酸供体,偏向不饱和碳链。途径下游的酶参与磷脂头基修饰。完整的膜蛋白CdsA催化三磷酸胞嘧啶(CTP)活化PA,生成二酰基-sn-甘油-3-(胞苷二磷酸)(二酰基-CDP -DAG)它是肯尼迪路径两个独立分支的先驱。导致最终产物PG形成的一个分支包括膜结合蛋白CDP-二酰基甘油-甘油3-磷酸3-磷酸3-磷脂酰转移酶(PgsA)由G3P和CDP-DAG合成磷脂酰甘油磷酸(PGP),随后由所述磷脂酰甘油磷酸酶A,B催化的去磷酸化步骤或C(PgpA,B或C)29。另一个分支在两步反应中生成PE作为最终产物。首先,由CDP-DAG和L-丝氨酸产生的磷脂酰丝氨酸(PS)由CDP-二酰基甘油-丝氨酸O-磷脂酰转移酶(PssA)催化。然后,PS脱羧形成PE,该反应由磷脂酰丝氨酸脱羧酶(Psd)催化,磷脂酰丝氨酸脱羧酶是一种由单个酶的自身催化丝氨酸分解产生的两个亚基蛋白。

所有七个基因,即plsB,plsC,cdsA,pgsA,pgpA pssA和psd都作为单个转录盒连接到单个质粒DNA中,即每个基因都在其自身的启动子,核糖体结合位点和转录终止子的控制下(图1a)。这种设计策略可确保将所有质粒包裹在脂质体中后,所有基因都以相同的拷贝数存在,从而避免了分离的DNA模板不均匀分配所固有的功能异质性。通过聚合酶链反应(PCR)将30个碱基对的接头序列添加到每个基因和线性化的pUC19质粒主链上,以实现最终质粒的单步Gibson组装。pGEMM7微型基因组的成功组装通过Sanger测序和限制性酶切消化得到证实。常见途径plsB,plsC和cdsA的三个基因,以及PE合成分支的两个基因pssA和psd在T7启动子的控制下,并在PURE frex 2.0 中组成性表达。编码PG生物合成酶的两个基因pgsA和pgpA在SP6启动子的控制下,并在相反的链上编码,以通过在T7终止子位点处不完全终止来防止通读转录。

 

 

PE和PG生物合成的转录调控

 

 

传统上,无细胞翻译产物的特征是使用同位素或荧光标记的氨基酸作为读数的一维十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。虽然这些方法适合分析单个或几个基因表达产物,但当多个蛋白质被共同合成时,它们的分辨率较差。在这里,作者应用了有针对性的LC-MS蛋白质组学方法来检测从头合成的酶,并验证SP6 RNAP对PgsA–PgpA途径的转录激活。

PURE frex 2.0反应中提供的大单层囊泡(LUV)充当表达的膜相关和整合膜蛋白的支架。鉴定出几种表达蛋白的蛋白水解肽,并将其观察到的碎片离子的总离子流归一化为源自伸长因子热不稳定(EF-Tu)的肽,EF-Tu是一种富含蛋白质的蛋白。纯系统。用胰蛋白酶对运行前PURE系统反应样品进行溶液内消化无法递送7种蛋白之一即PgpA的可检测肽。当省略SP6 RNAP时,未检测到PgsA的可检测量,表明pgsA基因的意外表达可忽略不计(图1b)。SP6 RNAP的浓度在0.01 U/µL和4U/µL之间变化时,PgsA逐渐增加。同时,随着SP6 RNAP浓度的增加,在T7启动子控制下PssA酶的浓度降低。这些结果表明靶向蛋白质组学对无细胞蛋白质合成的相对定量的作用。此外,他们验证了作者设计的属于正交转录途径的不同酶的可调节表达水平。

PE和PG脂质的成功生产及其遗传调控已通过LC-MS脂质组学分析得到证实(图  1c)。为了将新产生的脂质与脂质体膜中最初存在的脂质区分开来,将13 C标记的G3P用作同位素重的前体。油酰辅酶A用作酰基供体。通过在采集PURE系统样品之前和之后测量DOPG和DOPE标准品来实现绝对定量。与蛋白质组学数据一致,仅在SP6 RNAP存在下检测到了合成的DOPG(图  1c)。唯一大量积累的中间物种是DOPA。

 

 

PE和PG生物合成的代谢调控

 

 

由于作者发现不仅与膜和在胞质溶胶相关PSSA是Kennedy途径的蛋白质中独特。人们认为PssA 通过与富含PG / CL的膜结合而被激活,从而维持了大肠杆菌中酸性(PG和心磷脂,CL)和两性离子(PE)脂质之间的比率,而胞质形式则是潜在的(图2a)。作者试图利用这种反馈机制来提供膜内容稳态而不依赖于遗传控制。制备了具有不同DOPE和DOPG含量的LUV,并合成了在存在和不存在SP6 RNAP的情况下,通过LC-MS测定C标记的DOPE和DOPG(图2b,c)。在存在和不存在之间,观察到初始PG含量与合成PE产量之间存在明显的正相关。此外,观察到初始PG含量与合成PG的产量之间呈负相关。这些结果证实了通过PG含量对PssA活性进行变构调节的模型,为作者的系统提供了混合脂质成分的非遗传稳态。有趣的是,在低PG含量下,PE合成减少,而与PG合成途径分支的表达无关(图2b)。该结果表明,调节机制不仅仅由两个通路分支之间竞争驱动,但它也依赖于PSSA的结合-解离的膜(图2A)。作者还发现,在较高的初始PG摩尔下,PE和PG的合成总量要高约 2倍。此结果与以前的观察行PLSB活性通过PG促进。

图2:代谢反馈作为PE和PG无细胞合成的调节剂。

 

 

脂质体中PE和PG的区室生物合成

 

 

局部脂质体内的脂质合成对于实现自主生长的人工细胞至关重要。在存在LUV的情况下,成功地重组了7种用于PE和PG合成的基因编码酶,促使作者将整个反应链限制在最初包含PE和PG脂质的细胞大小的脂质体内。将PURE系统,pGEMM7微型基因组和可溶性磷脂前体封装在大而巨大的脂质体内。酰基链前体以干燥膜的形式提供,当悬浮在水溶液中时,分配在脂质体的膜中。通过在外部培养基中添加蛋白酶K或DNase I,将无细胞基因的表达限制在脂质体腔内。合成脂质产物的定量质谱分析表明,当所有反应均限于脂质体腔中时,可以合成多达20μM的磷脂终产物,相当于40%的酰基-CoA转化率(图3d)。酰基链前体棕榈酰基-CoA(16:0)和油酰基-CoA(18:1)都可以用作底物,从而分别合成了二棕榈酰和二油酰磷脂(图3d)。由于新合成的DOPE和DOPG也是亲本脂质体的组成部分,因此该结果代表了由基因组DNA导向的稳态膜生长的里程碑。没有蛋白酶K的对照实验(图3d),尽管囊外空间的反应体积大得多,但磷脂产量仅略高。这可以通过在脂质体内包封表明基因表达和/或脂质合成的可能的增强。

图3:巨大囊泡内的DNA程序化磷脂合成。

仅当SP6 RNAP被共包封时才观察到PG(图3d,e),这表明磷脂合成发生在脂质体内。根据LUV实验,PG合成的活化基本上不减少合成PE的量。在所有情况下,PG的最终产量都比PE的产量低约两倍,这反映了囊泡膜的初始PE / PG比。该结果表明,当脂质合成在脂质体内被分隔时,由PssA介导的稳态机制发生。此外,作者发现了磷脂中间体LPA,PA和CDP-DAG积累的证据,而PGP和PS没有积累。

然后,作者的目标是通过混合等摩尔量的16:0和18:1酰基辅酶A前体来扩大合成磷脂的种类。作者发现总合成磷脂终产物中82.9±0.4%(无SP6 RNAP)和79±11%(无SP6 RNAP)含有混合链产物(PO)(图3d),比假设随机加入链的50%预期值高得多。因此,合成的二油酰基(无SP6 RNAP时为8.8%±0.4%,有SP6 RNAP时为11%±9%)和二棕榈酰(无SP6 RNAP时为8.2%±0.3%,有SP6 RNAP时为9%±5%)的比例较低,但可观的。最后,有可能选择性地产生多达六种不同的脂质种类(DOPE,DOPG,DPPE,DPPG,POPE,POPG),并且在细胞大小的脂质体内通过一锅反应耦合基因表达和磷脂合成。

 

 

单个脂质体中膜合成的可视化

 

 

即使从高拷贝数的封装DNA分子中产生单个蛋白质,脂质体内基因的表达也具有高度的异质性。尽管LC-MS方法可以灵敏地检测脂质体群体中的多种脂质种类,但由于囊泡增溶,有关单个囊泡水平的脂质组成的信息会丢失。为了克服此限制并量化产生磷脂的脂质体的比例以及异质性程度,作者建立了两种基于荧光的成像分析方法。此外,光学显微镜方法使作者有机会确认作者的假设,即合成脂质被掺入脂质体膜中。

第一种方法是基于使用硝基苯并恶二唑(NBD)标记的棕榈酰-CoA作为磷脂合成的荧光底物(图4a)。通过高效液相色谱(HPLC)分析了NBD标记的酰基链整合到不同酶产物中的情况(图4b)。当在LUV的存在下仅表达部分酶促途径时,通过监测样品的色谱图可实现峰分配。假定在添加编码该酶下游酶的基因后出现的新峰对应于最终反应产物。通过这种方式,可以清楚地识别NBD标记的PA,PS和PE的签名(图4b,c)。此外,当pGEMM7在细胞大小的脂质体内表达时,检测到NBD标记的PA和PE(图4b)。这些结果证明了作者平台合成新型脂质种类的多功能性。

图4:NBD标记的磷脂的无细胞生物合成。

接下来,作者进行了荧光显微镜实验,以从脂质体内部成像新合成的NBD标记的磷脂物质的膜定位。作者认为,与在膜与本体相之间具有较快交换速率的单酰基物质(NBD-棕榈酰-CoA和NBD-LPA)相比,与NBD共轭的两酰基链磷脂产物更稳定地插入双层中。因此,在成功产生脂质后,预期脂质体膜上的NBD信号更强。棕榈酰基-CoA和NBD-棕榈酰基-CoA的混合物(摩尔比为9:1)用作酰基链前体。选择该比例可最大程度地减少在一条磷脂中掺入两条NBD标记链的可能性,这可能导致荧光团淬灭,同时产生足够高比例的NBD标记的磷脂进行成像。在pGEMM7表达后,将脂质体稀释以减少来自NBD-棕榈酰-CoA和NBD-LPA的膜信号。在对照样品中分析了NBD-棕榈酰-CoA与囊泡瞬时相互作用产生的背景信号,在对照样品中,在脂质体的内部和外部均添加了蛋白酶K以完全抑制基因表达。

分析了富含NBD的脂质体,即成功将NBD-棕榈酰-CoA转化为两个酰基化合物的脂质体。脂质体中pGEMM7的表达导致膜上的NBD信号更高,富集NBD的脂质体的百分比高于对照样品(图4d),这表明了单囊泡水平的磷脂生物合成。另外,当省略蛋白酶K时,富含NBD的脂质体部分的适度增加(〜50%)(图4d)可以通过脂质体限制反应中酶活性的增强来解释,如上文脂质生产所建议在人口水平(图3d,e)。

检测脂质合成和膜掺入的第二种策略依赖于作为PS特异性荧光报告基因融合到eGFP(LactC2-eGFP)的乳粘附素的C2结构域(图5a)。在150 nM的浓度下,LactC2-eGFP与含PS的膜结合,但不与PS被PG取代的膜结合。PS不是作者重构的脂质合成途径的最终产物,并且被Psd迅速转化为PE(。为了使PS积累,使用EcoRI对质粒DNA pGEMM7进行了线性化处理,该质粒在位于酶切位点的唯一限制性酶切位点进行切割psd基因。得到的构建体(命名pGEMM7Δ编码的路径的唯一终产物PSD),不添加SP6 RNAP时。使用pGEMM7ΔPSD作为导致PS的显著积累在脂质体的基因表达的模板,通过LC-MS。还测量了一些残留的PE合成,这很可能是psd基因限制不完全的结果。当将LactC2-eGFP加入进料溶液中以探测单个脂质体中PS的产生时,观察到一些脂质体的膜明显募集(图5b,c),表示PS富集。当省略油酰辅酶A或pGEMM7模板时,未观察到LactC2-eGFP的显着膜结合(图5b,d),证实了高PS特异性。自动化的图像分析使作者能够提取大量脂质体中eGFP的平均边缘强度。测量了在PS合成脂质体中eGFP强度值的广泛分布(图5d)。变异系数 比具有预定分数PS的对照样品高约2倍。该结果进一步支持脂质体包封的脂质合成的高度异质性。此外,作者发现〜50%的脂质体表现出PS富集(图5e)。当LactC2代替EGFP。

图5:使用LactC2-eGFP的内部PS产生的单泡成像。

图6:PS产生和探针募集的动力学。

作者注意到,与使用NBD标记的酰基前体相比,这种方法更可靠,并且提供更高的信噪比。此外,不需要洗涤步骤,从而使LactC2-eGFP成为出色的脂质探针,可以通过单个脂质体的实时荧光成像获得动力学信息。在0.5到6小时之间,可以观察到膜上LactC2-eGFP信号明显增加。(图6a,b)。对于表观直径在4至12μm之间的囊泡,没有观察到动力学参数相对于脂质体大小的明确依赖性(图6b)。另外,掺入膜中的从头合成的脂质的量不足以直接在光学显微镜下观察脂质体的生长(图6c)。当省略油酰辅酶A时,未观察到LactC2-eGFP信号强度的增加,证实了对合成的PS的特异性。为了阐明LactC2-eGFP信号增加的速率限制步骤和饱和原因,有必要进行进一步的研究。特别是,检查LactC2-eGFP募集是否由于停止PS生产而饱和将是十分重要的。

总之,在这项工作中,合成的微型基因组中编码的产生磷脂的酶在脂质体区室中无细胞表达。从头合成代谢途径将前体转化为多种脂质,包括亲本脂质体的成分。由于特定基因活性的转录调节与代谢反馈机制相结合,实现了磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油的平衡生产。已开发出基于荧光的方法,以在单个脂质体水平上对磷脂酰丝氨酸的合成和膜结合进行成像。作者的结果为最小细胞模型中DNA程序化的膜合成提供了实验证据。讨论了缓解目前有效脂质体生长和自我繁殖的局限性的策略。

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41467-020-17863-5

来源:生物医学科研之家

 

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