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武汉科技大学构建新型CRISPR/Cas12a生物传感器,帮助实现非核酸目标物的转导

  • 分类:行业新闻
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  • 来源:
  • 发布时间:2020-09-30 13:39
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近日,武汉科技大学医学院公共卫生学院李诚予副教授在CRISPR/Cas12a生物传感器的构建方面取得阶段性进展,研究成果“A boosting upconversion luminescent resonance energy transfer and biomimetic periodic chip integrated CRISPR/Cas12a biosensor for functional DNA regulated transduction of non-nucleic acid target”发表于SCI一区期刊《Biosensors and Bioelectronics》上。

近年来,基于Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) 的基因编辑技术受到了科学界的广泛关注。这项革命性技术的灵感是来源于细菌和病毒在生命进化历史上进行斗争所产生的免疫应答模式。简单来说,就是病毒能把自己的基因整合到细菌内,利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务,而细菌为了将病毒的外来入侵基因清除,进化出CRISPR系统。利用这个系统,细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的基因组上切除。

由于CRISPR系统需要核酸酶(Cas蛋白)结合一段引导RNA(CrRNA)来实现目标核酸的特异性识别,因此该技术在实际操作过程中具有很高的精准度。相比于早期发现的CRISPR/Cas9系统,近年来新发现的CRISPR/Cas12a系统不仅具备CRISPR/Cas9的cis cleavage功能,还可实现一种特殊的trans cleavage效应,即额外对任意“非目标”核酸序列进行切割。

近期,借助CRISPR/Cas12a优异的目标物识别精准度以及trans cleavage能力,研究人员基于电化学、比色、荧光等分析平台构建了一系列的生物传感器,其中荧光分析受到更为广泛的关注。但是,由于缺少有效的目标物转导模式,目前所报道的CRISPR/Cas12a传感器都只能用于单纯核酸的检测。为进一步扩大分析物的范围,李诚予副教授在本工作中将“功能化DNA”这一概念引入CRISPR/Cas12a系统以实现对非核酸目标物的转导。通过将适配体和DNAzyme作为功能化DNA,上述CRISPR/Cas12a传感器可有效对模型目标物ATP和Na+分别进行信号转导。

由于目前所构建的CRISPR/Cas12a荧光生物传感器都是基于传统的斯托克斯荧光发射模式(可见光激发),因此它们在复杂生物样本(如细胞提取液,人体体液)中仍存在挑战。为解决这一问题,李诚予副教授将“基于上转换发光的发光共振能量转移(LRET)”这一检测模式进一步引入到CRISPR/Cas12a系统中。由于上转换纳米颗粒(UCNP)的尺寸较大(一般> 20 nm), 将UCNP作为能量供体的LRET体系存在能量转移效率很低(一般< 50%)这一瓶颈。李诚予副教授在本工作中构建了一种“能量集中”型UCNP,即通过构建一种“三明治”结构的UCNP,将上转换发光区域极大地局限于一个很窄的内壳层内(~ 2.5 nm)。基于以上设计理念,上述改进的UCNP对其表面所偶联的报道DNA(修饰有BHQ-1分子)的能量转移效率可被显著提升至92.9%。

“能量集中”型UCNP与仿生周期芯片相结合的针对非核酸目标物的CRISPR/Cas12a生物传感器原理图

为进一步提升分析灵敏度并同时实现“即使检测”,李诚予随后将上述传感体系负载于一种特殊的“仿生”周期芯片当中。通过选用光子晶体作为信号放大器与芯片界面,上述上转换发光强度可被大幅提升35倍。同时,该传感器可在便携式手持980 nm激光器的照射下,通过手机拍照这一简单的方式来进行定量检测,对ATP和Na+的检出限可分别低至18 nM和0.37 μM,并具有很好的特异性。此外,该方法不仅可有效对单细胞水平内的ATP含量变化进行动态监测,还可准确分析低血钠患者中的血浆钠含量。

上述论文武汉科技大学为第一完成单位,李诚予副教授为第一作者兼通讯作者,武汉大学唐宏武教授为共同通讯作者,武汉大学郑贝博士为共同第一作者。该工作得到国家自然科学基金(21904102, 81772256和21827808)的支持。

论文链接:https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112650

来源:微流控

 

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